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马铃薯组织培养技术
组培室仪器设备
  
  1、种薯的茎尖脱毒
  
  植物组织培养也叫PlantTissueCulture,广义指在特定条件下,植物生长过程中,将离体的植物组织、细胞或原生质体,通过人工培养手段,促进其分化与生长,并在环境与技术的控制下,促使植物完成完整植株,过程生产次生代谢物质的技术。因为组织培养过程需要脱离母体完成,因此植物组织培养也叫离体培养。狭义指特定条件下,植物中的形成层、叶肉组织、薄壁组织、胚乳等部分,通过培养技术产生的植株,也是对植物器官组织的再培养,通过分化过程变成新的植物。
  
  选择产量较高或抗病能力较强的块茎洗净后,在32℃下催芽或自然发芽。当块茎出芽长约30厘米时,切取带顶芽或侧芽的茎段约10~15厘米备用。将茎尖先用自来水冲洗干净后,用75%的酒精浸泡30s,再用0.1%升汞浸泡8~10min,然后用无菌水冲洗3~4遍后,在显微镜下剥取带两个叶原基的茎尖接种到装有脱毒培养基的试管斜面上,每个试管内接种一块愈伤组织,在25℃左右的培养室进行培养。脱毒培养基一般为MS培养基中加入0.5mg·L-16-BA、0.1mg·L-1GA3和0.1mg·L-1NAA。观察其生长状况,剔除污染及未成活的试管苗。
  
  2、试管苗扩繁
  
  配制好MS培养基后,趁热分装入三角瓶中,进行高压灭菌。观察3~5天,剔除污染的试管后,准备接种。将工作服、套袖、剪刀、镊子、培养皿等进行高压灭菌。将拖鞋及灭菌好的工作服放入缓冲间,对接种室的空间进行熏蒸消毒,每接种一个星期左右熏蒸一次。将盛装75%的酒精瓶放在超净工作台附近,在工作台内放入酒精灯、打火机、浸泡的酒精棉球、灭菌器等所需物品,每次接种前需将超净工作台用紫外灯进行杀菌半小时左右,20min后工作人员方可进入。
  
  接种人员先换上拖鞋、剪掉手指甲、用香皂洗净双手后,进入到缓冲间内。换上拖鞋及工作服后,进入接种室,用75%的酒精对双手、套袖进行喷雾消毒,然后就座于超净工作台前,点燃酒精灯,用酒精棉球对双手及台面进行消毒,将试管先用酒精棉球擦拭,然后用酒精灯轻微灼烧试管口及棉塞,在酒精灯火焰下10cm以内拔掉棉塞,将镊子在酒精灯火焰下灼烧,带晾凉后夹出试管苗,用剪刀剪掉剩余培养基后,将试管苗放在培养皿内,培养皿在酒精灯附近10cm内。将剪刀进行酒精灯火焰灼烧晾凉后,用剪刀将试管苗剪为数段,每段要留1片小叶。将带有培养基的三角瓶先用酒精棉球擦拭,然后在酒精的火焰下对瓶口进行消毒,稍凉片刻,用镊子将试管苗在酒精灯火焰下10cm以内接入到三角瓶内,每瓶接种10段左右,火焰封口后,贴上标签,标签上要标注接种时间、品种及接种人。重复此操作直至将培养皿内的苗全部接完后,将培养皿用酒精棉球擦拭,在酒精灯火焰下灼烧后放回原处,进行下一个试管苗或另一个品种的接种操作。
  
  接种结束后,将接种好的三角瓶放到培养室内培养,25℃左右,每天用照明灯补光,光照16h,观察其生长状况,剔除污染及未成活的试管苗。一个月左右后进行下一次组织扩繁。
  
  3、壮苗及生根培养
  
  马铃薯组织培养时,增加细胞分裂素浓度,可以促进增殖系数的提升。但随着增殖系数的增多,会抑制增殖芽的生长趋势,不定芽更加细小,不能进行下一步生根培养;即使可以进行下一步,成活率也会降低,还需另外进行壮苗培养。马铃薯的壮苗培养基为1/3MS+0.05mg·L-1NAA。
  
  生根培养是使无根苗生根形成完整植株的过程,这个过程的目的就是使组培苗生长出浓密而粗壮的不定根,以提高组培苗对外界环境的适应力及驯化移栽的成果率,获得更多高质量的商品苗。马铃薯组培苗的生根培养是将未生根的组培苗转接入生根培养基中继续培养使其生根的过程。马铃薯的生根培养基为1/2MS+0.20mg·L-1NAA,适当加大植物生长素的用量,使其快速生根。
  
  4、煉苗及移栽
  
  马铃薯组培苗经过生根培养后,便可出瓶移栽。移栽后的组培苗需在特定条件下,如无菌条件、营养、温度、光照、湿度等,都有较高的要求,要想植物移栽后的生长满足生长条件,就需要人工创造条件。后期还需使用出瓶种植,让植物接触自然环境,与人工环境有较大差距,如温度与湿度等,改变了人为的条件,短时间中组培苗适应不能适应。因此,组培苗必须移出培养室,在室温下炼苗3-5天。
  
  移栽前一天揭开封口膜。移栽时,小心的用手洗去根部附着的培养基,水温在22℃左右,去掉培养基的苗再用清水洗两遍,要求认真细心,避免折断薯苗,清洗后的薯苗再置于一定浓度的杀菌剂溶液中浸泡5min后,立即移栽。按6~8cm的株距移栽入无土培养的基质上,摆苗要仔细,将苗的根系舒展好,覆土后可稍加镇压以提墒。移栽后浇透水,注意遮荫保湿,基质在使用前要用高锰酸钾进行消毒,不易过湿,以防烂苗。观察移栽苗的生长状况,及时剔除未成活的组培苗,进行种植的常规管理。
  
  二、马铃薯组织培养中的污染原因及控制措施
  
  1、组培苗污染
  
  产生组培苗污染的原因很多,如组织培养附近空气环境清洁度不足、过滤设备设施失效、相关器具与器皿中含有其他菌群、植物操作过程不正确等等。造成组培苗污染的病原有很多,主要有细菌、真菌、内源菌等。其中细菌的污染以芽孢杆菌最为普遍、严重,对其处理主要使用高压灭菌或者消毒手段。组培苗中产生真菌主要是因为主体接触不干净的物质,如灰尘而生长的,在此环境下,可以通过提升培养环境与操作环境方法减少真菌产生。另外植物组织培养过程中,内源菌污染的处理工作比较复杂。该污染指外植体材料内部中微生物,此处不能使用一般表面消毒方法清除,主要解决步骤为:①升级外植体的消毒方法,如间隙消毒;②使用前仔细检查培养物质量,阅读药品合格证与使用方法,因为有些污染需在很长时间之后才表现出来,甚至有些污染很难被发现,切记不能使用质量低或者过期药品做培养基;③适当使用抗生素。
  
  2、组培苗玻璃化
  
  植物组织培养过程中,经常遇见半透明状的畸形试管苗,对这类植物体叫做“玻璃苗”,此类现象叫做“玻璃化现象”,又称过度水化现象。组织苗一旦发生玻璃化,其组织结构发生变化,生理功能产生异常,主要体现为分化能力下降,不能独立增殖成芽或者生根,移栽到自然界中更是很难成活。因此要采取防治手段,主要有下面几点:①使用固体培养方法,提升琼脂浓度,减少培养基中衬质势。通过此方法可减少玻璃化概率;②适当提升培养基中蔗糖比例,降低培养基中的渗透势,减少植物材料吸收水分量,不会产生水分胁迫;③注意培养基的通气,如用棉塞,降低培养容器中空气湿度,优化氧气供应;④减少培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度;⑤采取低温处理手段。⑥增加自然光照;⑦增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量,降低氮氯比例,此处需注意降低铵态氮浓度,但是尽量提升硝态氮含量。
 
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